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qPCR檢測

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種研究基因表達(dá)量的重要方法，利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析。

qPCR重要參數(shù)

? 擴(kuò)增曲線

qPCR反應(yīng)開始時(shí)，熒光信號不穩(wěn)定，呈現(xiàn)波動狀態(tài)，隨后信號會趨于穩(wěn)定并且呈現(xiàn)指數(shù)性增長，到達(dá)一定循環(huán)數(shù)之后，熒光信號強(qiáng)度不再增加，持續(xù)穩(wěn)定。

擴(kuò)增曲線展現(xiàn)出來為一條S型曲線，包括：基線期，指數(shù)擴(kuò)增期，平臺期。反應(yīng)完成后，qPCR儀會以基線期熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍生成一條閾值線，閾值線與擴(kuò)增曲線產(chǎn)生交點(diǎn)，交點(diǎn)對應(yīng)的橫坐標(biāo)代表Ct值，Ct值的含義代表每一個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，其本質(zhì)不難看出就是循環(huán)數(shù)，它是熒光定量中唯一用于后續(xù)計(jì)算的數(shù)值，是后續(xù)定量計(jì)算的基礎(chǔ)。

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? 熔解曲線

熔解曲線是指隨著溫度升高，反映DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過逐漸增加溫度同時(shí)監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生熔解曲線，熔解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個(gè)特征峰就可以將特異性產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開。

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qPCR定量方法

定量方法包括相對定量和絕對定量，兩者的重要差異在于相對定量的結(jié)果是差異性的結(jié)果，涉及比較；而絕對定量的結(jié)果是一個(gè)具體數(shù)值，對于基因表達(dá)量而言是基因的拷貝數(shù)，不涉及任何比較。

? 相對定量

首先需要確定一個(gè)內(nèi)參基因，常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，其本質(zhì)作用是利用內(nèi)參基因的Ct值對目的基因的Ct值進(jìn)行均一化處理。其次，相對定量需要確定參照物，參照物選擇不同，所得的定量結(jié)果可能完全相反，經(jīng)常選擇的參照物一般是對照組或未處理組。

? 絕對定量

首先需要建立Ct值和拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)品生成。標(biāo)準(zhǔn)品中基因序列要與待測樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴(kuò)增效率完全相同。標(biāo)曲是由不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品生成，落在標(biāo)曲上的梯度點(diǎn)最好有5個(gè)及以上，標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品同時(shí)反應(yīng)，將待測樣品檢測的Ct值代入標(biāo)曲后即可換算出待測樣品中基因的拷貝數(shù)。

qPCR檢測方法

qPCR最常用的兩種檢測方法分別為SYBR Green染料法和TaqMan探針法。

? SYBR Green染料法

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green熒光染料，其特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的熒光染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

SYBR Green染料法需要注意引物的特異性，因?yàn)榉翘禺悢U(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體均為dsDNA，所以該方法只能通過引物來保證特異性。

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全式金推出的PerfectStart^? Green qPCR SuperMix采用PerfectStart^? Taq熱啟動酶，采用3種抗體封閉，有效地封閉了DNA聚合酶活性，阻止了低溫下的非特異性擴(kuò)增。

● 產(chǎn)品特點(diǎn)

? 3種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴(kuò)增效率強(qiáng)，適用物種范圍廣。

? 雙陽離子緩沖液，增強(qiáng)特異性，減少引物二聚體形成，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

? 配有適用于不同機(jī)型的Universal Passive Reference Dye (調(diào)整PCR加樣誤差引起的管間差異)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

● 3種抗體封閉原理圖

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● 封閉效果

以不同濃度人gDNA為模板擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PerfectStart^? Taq熱啟動酶的封閉效果。結(jié)果顯示，封閉后可顯著提高擴(kuò)增靈敏度和特異性。

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以小麥cDNA為模板，qPCR檢測PerfectStart^? Taq熱啟動酶的封閉效果。結(jié)果顯示，封閉后可顯著提高擴(kuò)增特異性。

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● 擴(kuò)增效率

以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA (10 ng-0.1 pg，10倍稀釋 ) 為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增效率較高，可得到漂亮的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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● 無NTC擴(kuò)增基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)

使用TransGen與Company T的產(chǎn)品，擴(kuò)增58個(gè)基因 (9個(gè)人的基因，7個(gè)小鼠的基因，17個(gè)水稻的基因，8個(gè)煙草的基因，4個(gè)擬南芥的基因，10個(gè)小麥的基因，3個(gè)玉米的基因)。無NTC擴(kuò)增基因數(shù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品無NTC擴(kuò)增基因數(shù)高于Company T，擴(kuò)增效果更佳。

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● 擴(kuò)增靈敏度

以500 ng的人源RNA反轉(zhuǎn)錄(TransGen, AT311)后得到的cDNA為模板梯度稀釋，分別使用TransGen與Company T產(chǎn)品擴(kuò)增β-actin (NTC無擴(kuò)增 )。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增靈敏度與Company T產(chǎn)品基本一致。

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● 不同物種模板擴(kuò)增

以不同物種的RNA反轉(zhuǎn)錄(TransGen, AT311)后得到的cDNA為模板分別使用TransGen與Company T的產(chǎn)品進(jìn)行擴(kuò)增(NTC無擴(kuò)增)。結(jié)果顯示，TransGen產(chǎn)品擴(kuò)增效果與Company T產(chǎn)品基本一致。

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● 產(chǎn)品穩(wěn)定性

不同溫度保存及反復(fù)凍融處理后TransGen產(chǎn)品仍可穩(wěn)定擴(kuò)增。

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? TaqMan探針法

PCR反應(yīng)開始時(shí)，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針和引物依次退火到模板上進(jìn)行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個(gè)堿基切除探針，發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。

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全式金推出的PerfectStart^? II Probe qPCR SuperMix UDG利用在PCR體系中加入熒光探針(TaqMan或Molecular Beacon等)，在擴(kuò)增過程中其熒光量與擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，最終通過熒光量的檢測測定樣本核酸量。

● 產(chǎn)品特點(diǎn)

? 3種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴(kuò)增效率高。

? 特殊優(yōu)化的qPCR反應(yīng)緩沖液，可提供更高的靈敏度和特異性。

? 使用UDG酶和dUTP，有效防止PCR產(chǎn)物污染，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

? 配有適用于不同機(jī)型的Passive Reference Dye (調(diào)整PCR加樣誤差引起的管間差異)，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

? 適用范圍廣，已成功用于非洲豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、哈維氏弧菌、蝦肝腸胞蟲和副溶血性弧菌等檢測。

? 穩(wěn)定性好，在反復(fù)凍融、預(yù)混液、常溫、37℃等條件下保存，均可穩(wěn)定擴(kuò)增。

? 提供可凍干版本。

● 多重PCR檢測

以牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) cDNA、豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV) cDNA、非洲豬瘟病毒(ASFV)質(zhì)粒、偽狂犬病病毒(PRV)gDNA混合物為模板，進(jìn)行qPCR檢測。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品可進(jìn)行4重檢測。

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● 高靈敏度、高擴(kuò)增效率

分別以不同濃度豬藍(lán)耳病病毒(PRRSV) cDNA(10 pg、0.1 pg、0.01 pg)及不同濃度牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) cDNA（100 pg、1 pg、0.1 pg）為模板，使用TransGen、Company V、Company T產(chǎn)品進(jìn)行qPCR檢測。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品靈敏度可達(dá)0.1 pg，擴(kuò)增效果優(yōu)于Company V與Company T。

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