外泌體系列
外泌體(Exosome)由細胞產(chǎn)生,是直徑介于30-150 nm的磷脂膜分泌性囊泡,廣泛存在并分布在各種體液中(如血清、血漿、唾液、尿液)和細胞培養(yǎng)液等。目前的主流觀點認為,外泌體的產(chǎn)生先是由細胞膜內(nèi)陷,形成早期內(nèi)小體(Early endosome),成熟晚期內(nèi)小體(Late endosome)的膜向內(nèi)萌發(fā)形成腔內(nèi)小泡(intraluminal vesicles,ILV)并轉(zhuǎn)化為多泡體(multivesicular bodies,MVB)。在MVB與質(zhì)膜融合后,ILV被釋放到細胞外形成外泌體(Exosome)。外泌體中攜帶有母細胞的多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA等生物活性分子,參與機體多種生理和病理過程。
外泌體形成過程[1]
外泌體的發(fā)展歷程
目前,已有越來越多的學者開始關(guān)注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制,外泌體將在癌癥的診斷及治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。有關(guān)外泌體的研究,主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內(nèi)容物分析上。
外泌體的作用
1. 作為藥物的載體進行藥物靶向治療
RNA藥物治療是一項極具潛力的治療手段,但是由于難以掌握RNA藥物遞送的穩(wěn)定性和特異性,它的應(yīng)用難度也隨之增加。利用外泌體進行RNA的傳遞則可以解決這個問題。例如:將加載融合RVG肽的Lamp2b蛋白的外泌體靜脈注射至小鼠體內(nèi),檢測發(fā)現(xiàn)其特異性的敲降了小鼠體內(nèi)BACE1(阿爾茨海默病的治療靶點)的表達[2]。
2. 作為細胞間的信號分子,用于細胞交流
外泌體作為細胞間的信號分子,在細胞間的信息傳遞中發(fā)揮著重要作用。例如:MPC(肌源性祖細胞)分泌含有miR-206的外泌體,來抑制成纖維細胞中Rrbp1(膠原蛋白合成的主要調(diào)節(jié)劑)的產(chǎn)生,從而防止過多的膠原蛋白在ECM(細胞外基質(zhì))沉積,以穩(wěn)定組織狀態(tài)[3]。外泌體miR-155中miRNA可以調(diào)節(jié)下游細胞對胰島素的敏感性[4]。
3. 調(diào)節(jié)細胞內(nèi)分子水平,從而調(diào)節(jié)細胞活性
外泌體不僅可以作為細胞間信號調(diào)節(jié)的載體,也可以主動運載細胞內(nèi)各種成分,進而調(diào)節(jié)細胞活性。例如:當MLKL被RIPK3磷酸化以后,磷酸化的MLKL會引起細胞的死亡,然而MLKL產(chǎn)生的外泌體可將磷酸化MLKL裝入囊泡,并分泌到細胞外,使細胞免受死亡[5]。
4. 作為分子診斷的Marker,用于疾病的診斷
相比于傳統(tǒng)活檢,液態(tài)活檢取樣方便、對機體損傷小。存在于體液和細胞培養(yǎng)液的外泌體因其特異性和相對穩(wěn)定性,在作為疾病診斷的Biomaker方面具有很大的潛力。例如:前列腺癌基因3(Prostate Cancer Associated 3,PCA3)、跨膜絲氨酸蛋白酶2 (Transmembrane Serine Proteases 2,TTSPs 2)和ETS 相關(guān)基因(ETS-related gene,ERG)融合基因在PCa患者尿液外泌體中表達,尿液外泌體具有作為PCa診斷的的潛力[6]。Raimomlo等對比了腎癌患者尿液中檢測到的186個蛋白,發(fā)現(xiàn)其中10個蛋白的表達有明顯差異,腎癌患者顯著高表達MMP9、DKK4和CAIX,且與腫瘤進展密切相關(guān),提示它們有望成為潛在的分子標志物,為腎癌診斷和治療提供有價值的臨床信息[7]。
外泌體的提取方法
目前外泌體常見的提取方法包括超速離心法、密度梯度離心、聚合物沉降法和特異性抗體捕獲等方法。
1. 超速離心法
優(yōu)點:方法簡單,適合大劑量的樣品處理。
缺點:操作繁瑣,費時費力,離心力可能導致外泌體結(jié)構(gòu)破壞,對設(shè)備要求高。
2. 密度梯度離心法
優(yōu)點:純度相對較高,適合大劑量的樣品處理。
缺點:操作繁瑣,費時費力,對設(shè)備要求高。
3. 聚合物沉降法
優(yōu)點:操作簡單,不需要超速離心機,得到的外泌體數(shù)量較多,適合大劑量的樣品處理。
缺點:雜質(zhì)含量會比較多,尤其是一些雜蛋白。
4. 分子排阻法
優(yōu)點:純度相對較高,且外泌體結(jié)構(gòu)不易受到破壞。
缺點:大小相近的顆粒也會被純化出來,比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。
5. 超濾法
優(yōu)點:操作方便,富集效率比較高,成本較低。
缺點:外泌體易損耗變形,導致膜堵塞,純度較低,大顆粒蛋白污染嚴重,附著于膜上的外泌體難以回收,導致提取損失。
6. 磁珠特異性捕獲法
優(yōu)點:外泌體純度較高,并且對外泌體膜結(jié)構(gòu)影響較小。
缺點:成本較高,無法進行大劑量的提取,磁珠保存難度比較高。
目前外泌體提取方法,普遍存在回收率低,純度低,操作繁瑣,結(jié)構(gòu)不完整等問題。針對上述問題,北京全式金生物技術(shù)有限公司開發(fā)了兩款外泌體提取新產(chǎn)品,可從血清、血漿、細胞上清和尿液中提取外泌體,適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式(NanoFCM)分析、Western Blot、熒光定量(qPCR)等應(yīng)用。
TransExo? Cell Media Exosome Kit
針對細胞上清中外泌體提取、純化的產(chǎn)品,所得的外泌體具有高純度、高活性的優(yōu)點,可以用于Western Blot、透射電鏡、qPCR、粒徑等多種檢測方式。
● 操作簡單,無須超速離心。
● 樣本需求量少,靈敏度高。
電鏡檢測
使用TransGen和Company Q產(chǎn)品提取MDA-MB-231和Hela細胞上清中外泌體,
電鏡檢測結(jié)果顯示均可檢測到結(jié)構(gòu)完整的外泌體。
外泌體標志性蛋白檢測
MDA-MB-231 細胞分別進行饑餓誘導處理和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),使用 TransGen 產(chǎn)品和 Company Q 產(chǎn)品提取細胞上清中的外泌體,WB 檢測結(jié)果顯示均可檢測到外泌體的標志蛋白 TSG101、CD63、CD81。
外泌體RNA檢測
使用 TransGen 和 Company Q 產(chǎn)品成功提取外泌體后進行 total RNA 提取,反轉(zhuǎn)錄后定量檢測miRNA (miR-92a)、lncRNA (RN7SL)、mRNA (MTND4) 表達。結(jié)果顯示均可檢測到三種 RNA 表達。
適用于多種細胞上清外泌體提取
TransGen 產(chǎn)品提取不同種類細胞上清中的外泌體,WB 檢測結(jié)果顯示均可檢測到
外泌體的標志蛋白 TSG101。
TransExo? PS Exosome Isolation Kit (FE601)
以磁珠為核心原料,通過磷酯酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)親和受體蛋白的作用,特異性捕獲血清、肝素血漿、尿液、細胞培養(yǎng)上清等多種樣本中的外泌體。提取的外泌體適用于Western Blot、qPCR、電鏡、納米粒子追蹤等多種檢測,同時可用于細胞共培養(yǎng)。
? 操作簡單,無需超速離心,能夠在3 小時內(nèi)完成外泌體純化。
? 相較于超速離心法,特異性更強,純度更高。
? 洗脫條件溫和,提取的外泌體形態(tài)良好,結(jié)構(gòu)完整,活性高。
原理示意圖
粒徑檢測
使用TransGen 產(chǎn)品提取HEK-293T 細胞上清、血清和尿液中的外泌體,經(jīng)粒徑檢測,提取的外泌體平均粒徑在100 nm左右。
電鏡檢測
使用TransGen 產(chǎn)品提取HEK-293T 細胞上清、血漿和尿液中的外泌體,
經(jīng)電鏡檢測,提取的外泌體呈經(jīng)典的盤狀囊泡形態(tài),結(jié)構(gòu)完整。
外泌體標志性蛋白檢測
使用TransGen 產(chǎn)品提取血清、血漿、尿液和多種類型細胞上清中的外泌體,WB 檢測外泌體標志物CD63 和TSG101 的表達。
外泌體 RNA 檢測
使用TransGen 產(chǎn)品提取不同種類樣本的外泌體后進行total RNA 提取,可檢測到多種miRNA(has-miR-150-3p、has-miR-16-1-3p、
has-let-7a-5p、has-miR-92a-3p) 、lncRNA(RN7SL)、mRNA(Actin) 的表達。
活性檢測
在MDA-MB-231 細胞中加入TransGen 產(chǎn)品提取的外泌體后,細胞遷移率隨著加入外泌體的含量增加而提高,表明提取的外泌體具有生物活性。
與沉淀法提取外泌體的比較
分別用磁珠法和沉淀法提取HEK-293T 細胞上清的外泌體,WB 檢測相同總蛋白中的
外泌體標志物CD63 和CD81 的表達,結(jié)果表明,磁珠法提取的外泌體純度更高。
外泌體是由細胞分泌的膜性小囊泡,攜帶著細胞來源的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA等分子。這些物質(zhì)作為細胞間的信號分子,用于細胞間交流。開展外泌體中RNA研究,有助于深入了解外泌體的作用。全式金生物開發(fā)了針對血清/血漿中外泌體RNA提取新產(chǎn)品,可提取血清/血漿中外泌體中的總RNA。
外泌體相關(guān)產(chǎn)品推薦
參考文獻
[1] Roles of Exosomes in Ocular Diseases.
[2] Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.
[3] Myogenic Progenitor Cells Control Extracellular Matrix Production by Fibroblasts during Skeletal Muscle Hypertrophy.
[4] Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.
[5] MLKL,the Protein that Mediates Necroptosis, Also Regulates Endosomal Trafficking and Extracellular Vesicle Generation.
[6] Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.
[7] Differential protein profiling of renal cell carcinoma urinary exosomes.