等溫擴增技術(shù)系列
近些年來，分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展持續(xù)推動著分子診斷技術(shù)的升級迭代，伴隨著新冠疫情的爆發(fā)，分子診斷技術(shù)在疾病診斷中發(fā)揮著重大作用，人們對分子診斷技術(shù)的重視程度達到了前所未有的高度。自沃森和克里克揭秘“生命之謎”-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)始，分子診斷經(jīng)分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)和二代測序技術(shù)的不斷發(fā)展后，已經(jīng)在多個領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，如傳染病的診斷、流行病學的調(diào)查、腫瘤和遺傳病的早期診斷、食品衛(wèi)生安全等。
其中，作為分子診斷經(jīng)典技術(shù)之一的PCR，憑借其簡便快速、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢，成為目前臨床基因擴增實驗室接受程度最高、應(yīng)用范圍最廣的技術(shù)。然而，PCR技術(shù)是在體外通過反復(fù)的溫度變化來達到對目的片段在短時間內(nèi)擴增數(shù)百萬倍的效果，這也就意味著PCR技術(shù)無法擺脫儀器設(shè)備的局限，不僅如此，PCR技術(shù)操作起來比較復(fù)雜，對人員要求也比較高，這些問題進一步限制了其在臨床現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。為了解決PCR這一局限性，自20世紀90年代以來，很多實驗室開始自發(fā)的研究無需熱變性的核酸等溫擴增技術(shù)(Isothermal Amplification Technology, IAT)。
等溫擴增技術(shù)是核酸體外擴增技術(shù)，其反應(yīng)過程始終在一個恒定的溫度下進行，通過在反應(yīng)體系中添加不同活性的酶和各種特異性的引物來達到快速擴增的目的。經(jīng)過30多年的發(fā)展，主流的等溫擴增技術(shù)包括環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴增(crossing priming amplification，CPA)、鏈替代擴增(strand displacement amplification，SDA)、重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴核酸序列的擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RCA)和依賴解旋酶的擴增(helicase-dependent amplification，HDA)。
在這些恒溫擴增技術(shù)中，以2000年日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開的LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)，也就是環(huán)介導等溫擴增反應(yīng)最受關(guān)注，是目前最常見、應(yīng)用最廣泛的等溫擴增技術(shù)，已占據(jù)超過60%的恒溫檢測市場。被廣泛地運用在病原微生物檢測和傳染性疾病診斷等領(lǐng)域，如SARS、AIV、HIV、COVID-19等疾病的檢測中，為已知基因的檢測提供簡便、快速、特異、經(jīng)濟的檢測方法，顯示出令人鼓舞的應(yīng)用前景。
LAMP原理
最初的LAMP反應(yīng)是針對目的DNA鏈上的6個區(qū)域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）設(shè)計4條引物，包含一對外引物（F3&B3）和一對內(nèi)引物（FIP&BIP）。其原理是利用雙鏈DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，在此溫度下，引物結(jié)合在雙鏈DNA的互補部位，鏈置換DNA聚合酶將DNA雙鏈解開并進行鏈置換，使DNA在15-60分鐘內(nèi)即可擴增109-1010倍。
LAMP擴增體系
基于LAMP擴增的原理，LAMP的擴增體系包括4條特異性引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、MgSO4。
4條特異性引物的組成：
· 正向外引物F3：由F3區(qū)域組成，該區(qū)域與F3c區(qū)域互補；
· 反向外引物B3：由B3區(qū)域組成，該區(qū)域與B3c區(qū)域互補。
· 正向內(nèi)引物FIP：由與F2c區(qū)互補的F2區(qū)（3’端）和與5’端的F1c區(qū)相同序列組成。
· 反向內(nèi)引物BIP：由與B2c區(qū)互補的B2區(qū)（3'端）和與5'端的B1c區(qū)域相同序列組成。
LAMP引物設(shè)計
正確的引物設(shè)計對于進行LAMP擴增至關(guān)重要，LAMP引物設(shè)計時，需注意以下幾點：
· 引物間距：F2和B2的5'端之間的距離為120-180 bp，F(xiàn)2和F3以及B2和B3之間的距離為0-20 bp。莖環(huán)區(qū)域的距離（F2的5'到F1的3'，B2的5'到B1的3'）為40-60 bp。
· 引物的Tm值：高GC和正常情況下約60-65℃，高AT情況下約55-60℃。
· 引物末端的穩(wěn)定性：從以下末端區(qū)域計算6bp的dG應(yīng)小于-4 kcal/mol，分別是F1c/B1c 的5'末端和F2/B2以及F3/B3的3'末端。
· GC含量：高GC和正常的情況下約為50-60%，高AT的情況下約為40-50%。
· 二級結(jié)構(gòu)：引物設(shè)計應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu)，3'序列應(yīng)避免高AT或與其他引物互補。
· 其他：如果目標序列上存在限制性內(nèi)切酶位點，除了引物區(qū)域外，它們可以用來確認擴增產(chǎn)物。
LAMP反應(yīng)核心的Bst DNA聚合酶，源于Geobacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪芽孢桿菌），原菌種生長于55-60℃的環(huán)境中。野生型Bst DNA Polymerase和其他DNA Polymerase I相似，包括三個活性區(qū)域: (I) 5’-3’外切酶活性結(jié)構(gòu)域，(II) 5’-3’聚合酶活性結(jié)構(gòu)域，(III) 3’-5’外切酶活性結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域II和III稱為大片段(LF)（大片段的反應(yīng)效率比全長Bst高），位于Bst DNA聚合酶的羧基末端，缺失5’-3’外切酶活性。
Bst DNA聚合酶的鏈置換原理
LAMP擴增步驟
當目的基因和試劑在65℃條件下孵育時，等溫擴增反應(yīng)分為2個階段進行，分別是啞鈴狀模板結(jié)構(gòu)的形成過程、循環(huán)擴增階段以及延伸循環(huán)階段。步驟如下：
1. 啞鈴狀模板結(jié)構(gòu)的形成：內(nèi)引物結(jié)合目的基因，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸為雙鏈。外引物與雙鏈DNA的5’結(jié)合，在一端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。另一端經(jīng)過同樣過程，形成兩端為環(huán)的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。
2. 循環(huán)擴增階段以及延伸循環(huán)階段：以啞鈴結(jié)構(gòu)DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開口的過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，由內(nèi)外引物引導過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應(yīng)，最后形成具有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度不一的DNA混合物。
LAMP擴增步驟
LAMP擴增產(chǎn)物檢測
LAMP擴增后可產(chǎn)生大量具有不同長度、不同數(shù)目莖環(huán)結(jié)構(gòu)和反向重復(fù)序列的DNA混合物，此外，隨著擴增反應(yīng)的不斷進行，副產(chǎn)物焦磷酸鎂的含量也在不斷增加。由于LAMP反應(yīng)的特殊性，其擴增產(chǎn)物的檢測也存在多種方式。
· 瓊脂糖凝膠電泳法：通過瓊脂糖凝膠電泳對LAMP擴增產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果呈現(xiàn)瀑布狀梯形條帶，針對擴增產(chǎn)物中所包含的特異性酶切位點進行酶切，還可以對擴增產(chǎn)物的特異性進行驗證。但高濃度DNA產(chǎn)物容易產(chǎn)生氣溶膠造成實驗室環(huán)境污染。
· 濁度分析鑒定法：LAMP反應(yīng)的效率極高，核酸在大量合成的同時，由dNTP析出的焦磷酸根離子與體系中的鎂離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，形成乳白色沉淀，焦磷酸鎂的產(chǎn)量與擴增產(chǎn)物濃度存在一定相關(guān)性?？捎萌庋塾^察擴增終末階段的乳白色沉淀判斷擴增有效性，也可利用濁度儀對濁度變化進行實時監(jiān)測。但濁度信號是來源于LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物，而不是由引物特異性擴增的直接產(chǎn)物，因此無法完全排除檢測到非特異性擴增（如，由宿主來源的近源DNA片段或引物二聚體）的可能。
· 染色檢測法：根據(jù)染料對反應(yīng)是否產(chǎn)生抑制，染料可在反應(yīng)后或反應(yīng)前添加。在反應(yīng)后開蓋添加，易在空氣中產(chǎn)生氣溶膠，并在之后的檢測中造成假陽性。染料和輔助劑的種類也會對反應(yīng)效率及結(jié)果判斷造成影響。因此，根據(jù)染料、輔助劑的作用特點進行合理的選擇及應(yīng)用，對LAMP結(jié)果的正確性和可靠性有重要意義。染料的種類有很多，應(yīng)用較多的有3種：鈣黃綠素、SYBR Green 和羥基萘酚藍。
· 免疫試紙條法：特異性擴增產(chǎn)物能夠同時被質(zhì)控線（C）和檢測線（T）上的抗體捕獲并顯現(xiàn)為兩條紅色條帶，而非特異性擴增的樣品則僅僅顯示為質(zhì)控線（C）紅色，但該方法需要借助其他的裝置來防止核酸擴增結(jié)束后開蓋可能造成的交叉污染。
· 實時熒光法：利用SYBR Green I等熒光染料能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合的特性，通過核酸擴增過程中的熒光強度變化來實時、定量地檢測雙鏈DNA的產(chǎn)量。該方法具有重復(fù)性高、能夠定量、實時分析的特點，但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
· 熒光探針法：向LAMP反應(yīng)體系中加入標記不同熒光素的特異性探針，可用于多重基因的檢測，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢。但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
· 微流控芯片法：該方法具有特異性強、敏感度高、耗樣量少、耗時短、檢測效率高、操作簡便等諸多優(yōu)點。將環(huán)介導等溫核酸擴增和微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，建立單重/多重、定性/定量的LAMP微流控芯片模塊，有利于發(fā)展快速、靈敏、特異和適合床邊檢測的生物分子分析技術(shù)。但需要復(fù)雜的儀器，成本高。
LAMP的優(yōu)勢與限制
LAMP的優(yōu)勢：
· 不需額外的步驟將雙鏈DNA變成單鏈DNA；
· 擴增反應(yīng)在等溫條件下連續(xù)進行；
· 擴增效率極高，在15-60分鐘內(nèi)使DNA的量放大109-1010倍；
· 通過4個引物來識別6個區(qū)域，擴增的特異性強；
· 不需要特殊的試劑或復(fù)雜的設(shè)備，成本低；
· RNA模板的擴增過程與DNA模板相同，只需添加逆轉(zhuǎn)錄酶。
LAMP的限制：
· 引物設(shè)計要求高；
· 產(chǎn)物不能用于克隆或測序；
· 容易形成氣溶膠污染，造成假陽性。
產(chǎn)品推薦
全式金作為國產(chǎn)生物試劑優(yōu)質(zhì)供應(yīng)商，為滿足廣大客戶對LAMP技術(shù)在病原微生物檢測、傳染性疾病診斷和食品衛(wèi)生安全等領(lǐng)域的應(yīng)用需求，推出Bst II DNA Polymerase和Bst III DNA Polymerase，助力診斷試劑開發(fā)。
適用于以DNA為模板的LAMP反應(yīng)，擴增能力強、特異性高，在熒光定量法（染料法、探針法）LAMP反應(yīng)中具有極佳的反應(yīng)性能。
產(chǎn)品特點：
· 操作簡單：包含反應(yīng)所需組分，只需自備模板及引物探針即可；
· 高效率：強鏈置換及聚合酶活性，實現(xiàn)恒溫條件下快速、高效、特異性的LAMP擴增；
· 兼容dUTP/UDG：對dUTP耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)準確。
實驗數(shù)據(jù)：
兼容dUTP/UDG防污染系統(tǒng)
以ASFV-p72質(zhì)粒和Pre-LAMP Product為模板，使用TransGen產(chǎn)品進行LAMP擴增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品對dUTP耐受性好，高度兼容dUTP/UDG系統(tǒng)，有效避免交叉污染。
擴增靈敏度高
以不同濃度的番鴨細小病毒（MDPV）質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進行LAMP擴增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴增靈敏性高，特異性好，檢出限可到fg級別。
注：1*102 copies濃度為fg級別
擴增速率快
在同等模板濃度條件下，分別使用TransGen產(chǎn)品和Company N產(chǎn)品進行LAMP擴增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴增速率更快。
反應(yīng)可視化
以ASFV-p72基因質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進行濁度法、HNB和中性紅顯色法LAMP擴增，63℃反應(yīng)30 min。結(jié)果表明TransGen產(chǎn)品可進行可視化操作，擴增結(jié)果均可通過顏色變化進行判讀。
1-4：ASFV-p72基因質(zhì)粒；5-8：NTC
Bst III DNA Polymerase (LP311)
適用于以RNA為模板的RT-LAMP反應(yīng)，具有極強的反轉(zhuǎn)錄活性和擴增能力，可在30分鐘內(nèi)檢測低至1拷貝的RNA分子，適用于熒光染料法、熒光探針法。
產(chǎn)品特點：
· 操作簡單：包含反應(yīng)所需組分，只需自備模板及引物探針即可；
· 高效率：一步法進行反轉(zhuǎn)錄（RT）及LAMP擴增，恒溫條件下快速、高效、特異性的擴增模板；
· 兼容dUTP/UDG：對dUTP 耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP產(chǎn)物的交叉污染，數(shù)據(jù)準確；
· 提供可凍干反應(yīng)體系：高濃度Bst III酶活穩(wěn)定，可用于凍干反應(yīng)體系的建立。
實驗數(shù)據(jù)：
擴增效率高
以鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，分別使用TransGen產(chǎn)品和Company N產(chǎn)品進行LAMP擴增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴增效率更高。
擴增靈敏度高
以不同濃度的鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，使用TransGen產(chǎn)品進行RT-LAMP擴增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴增靈敏性高，特異性好，檢出限可到fg級別。
注：1 copy濃度為fg級別
可進行凍干
以鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，使用常規(guī)和凍干體系 TransGen產(chǎn)品進行RT-LAMP擴增。結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品擴增效果穩(wěn)定，可用于凍干體系研究。
參考文獻：
【1】 Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR?. Cells. 2021;10(8):1931. Published 2021 Jul 29.
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