CircRNA鑒定及研究方法

環(huán)狀RNA（Circular RNA，縮寫為CircRNA）屬于非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA），是近些年新興的一個重要研究熱點。CircRNA是一類不具有5'端帽子和3'端poly(A)結構，并且以共價鍵形成環(huán)狀分子結構的RNA分子（圖1）。CircRNA主要是通過反向剪接（back-splicing）的方式產生，明顯不同于線性RNA（linear RNA）經典的5'–3'的模式。

每一個研究熱點背后都有它的背景故事，從不被認知到受到廣泛的親賴。下面，就讓我們一起看一下CircRNA的發(fā)現史。

CircRNA發(fā)現史

◆  1976年，美國農業(yè)部的科研工作者在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中發(fā)現類病毒（Viroids）能侵染植株并導致死亡。但與常規(guī)病毒不同的是，發(fā)現的類病毒并沒有蛋白質外殼包被，核酸是單鏈、閉合、RNA分子。

◆  1979年，洛克菲勒大學的Hsu和Coca-Prados，用電子顯微鏡在真核細胞細胞質中觀測到環(huán)狀RNA的存在，這為CircRNA存在提供了最直接的證據。

◆  1991年，Nigro在HCT116等人源細胞DCC基因中發(fā)現轉錄的CircRNA。

◆  1993年，Capel在成年小鼠睪丸中發(fā)現精子決定基因Sry中存在CircRNA的轉錄。

◆  2006年，Houseley在果蠅中發(fā)現來自于Muscleblind基因的未知環(huán)狀轉錄本。

◆  2012年，Salzman通過RNA-Seq方法首次報道了大約80個環(huán)狀RNA分子。至此借助于高通量測序技術，環(huán)狀RNA的研究，正式開始大量進入人們的視野。

◆  2013年，Nature雜志兩篇重要的研究論文揭示出一些環(huán)狀RNA充當分子“海綿”，結合并封閉了microRNAs。自此，環(huán)狀RNA在科學界受到了前所未有的關注。

隨著環(huán)狀RNA功能、作用被逐步揭開，環(huán)狀RNA的研究也越來越受到重視。接下來，就讓我們從CircRNA的分類、作用、鑒定方法和研究方法四個方面，詳細的了解下circRNA。

CircRNA的分類

CircRNA在各種動物、植物、昆蟲和真菌等均有發(fā)現。到目前為止，主要發(fā)現了大約183000種人源circRNA，96000種猴源circRNA和82000種鼠源circRNA[1]。與mRNA等線性RNA相比，circRNA在機體內的表達量較少，但表達模式卻與其線性同源RNA不同，其表達不依賴于其同源的線性RNA。

CircRNA按照含有的外顯子和內含子模式的不同，主要可以分為以下四類：

1) 單外顯子circRNA，single exon circRNA；

2) 多外顯子circRNA，multi-exon circRNA；

3) 外顯子和內含子共存的circRNA，exon-intron circRNA；

4) 內含子circRNA，intronic circRNA；

CircRNA的作用

? 作為miRNA的sponge/decoy（海綿）

例如：在哺乳動物的大腦中富含的CDR1as（也稱作ciRS-7）包含有70多個miR-7的保守結合位點，在人源細胞系中減少CDR1as的表達，可以顯著的減少包含有miR-7結合位點mRNA在細胞中的含量[6]。

? 作為RBP（RNA Bingding Protein）的sponge/scafford（海綿）

例如：與動脈粥樣化疾病相關的CircANRIL，通過結合核糖體60S亞單元組裝因子，來抑制血管平滑肌細胞和巨噬細胞中核糖體的形成，從而造成動脈粥樣化的壓力和細胞死亡[7]。

? 參與蛋白的翻譯或其本身被翻譯

例如：Circ-ZNF609可以不依賴于剪接和加帽而翻譯成蛋白，產生的蛋白在肌肉分化中起到一定的作用[8]。

? 調控基因的轉錄

例如：擬南芥中，SEPALLATA3（也稱SEP3）是在花的同源異形表型中所必須的，而CircSEP3可以調控SEP3基因的剪切。CircSEP3來源于SEP3的外顯子6，并與之形成了一個RNA-DNA的雜合鏈，這導致了外顯子6的轉錄終止，從而發(fā)生了外顯子跳躍，導致產生了一個新的SEP3的mRNA剪切體[9]。

? 腫瘤發(fā)生的調控

例如：HPV（human papillomavirus）會產生包含有致癌性E7基因的CircE7，其中HPV-16產生的CircE7會翻譯生成E7致癌蛋白。在CaSki宮頸癌細胞中，減少CircE7含量會導致E7蛋白的減少，并且會抑制細胞的生長，這項結果在細胞水平上和體內實驗都得到了驗證[10]。

? 神經調控

CircRNA還可能在免疫、發(fā)育等過程中起到重要的作用。

CircRNA的鑒定方法

RNase R消化檢測

RNase R是一種來源于大腸桿菌的核酸外切酶，它可以沿RNA的3’-5’方向切割、降解RNA，能夠消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化呈環(huán)形的RNA、套索結構或3’端突出末端少于7 nt的雙鏈RNA分子（圖4）。

RNase R檢測并非是必須的，但可以作為一個很典型的實驗證明和鑒定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鑒定和富集實驗，需要根據具體的實驗內容和目的決定是否進行RNase R消化。

RNase R并不是絕對的不能消化circRNA，消化時間過長、RNase R的用量過高都有可能會導致在酶消化后CircRNA的含量也有明顯降低（圖5），所以在使用RNase R進行消化時，還要進行相應的預實驗，設置好相應的對照，看是否對于所要研究的CircRNA有明顯的影響，保證實驗結果的準確性。

qPCR檢測

qPCR檢測通過引物特異性和位點設計來保證所檢測的為環(huán)狀RNA，一般多用于高通量測序后的數據驗證及后續(xù)功能研究的定量檢測（圖6）。Convergent引物作為參照，不管是基因組或線性RNA還是環(huán)狀RNA均可擴增，而Divergent引物只有環(huán)狀RNA可以被擴增出來。

如果是以qPCR進行定量檢測，一般可以不做RNase R檢測，即不需要對circRNA進行富集（線性RNA被消化）。

RNA-Seq檢測

CircRNA的研究方法

隨著對CircRNA的了解，研究方法也在不斷的成熟。這里我們?yōu)榇蠹艺砹私陙淼腃ircRNA的研究方法，供大家參考[1]

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參考文獻

[1] The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs. Molecular Cell Biology.

[2] Electron microscopic evidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryotic cells.Nature.

[3] Circular RNAs: Biogenesis, Function and Role in Human Diseases. Frontiers in Molecular Biosciences.

[4] Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed. Molecular Cell.

[5] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.Nature.

[6] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature.

[7] Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF- associated non- coding RNA correlates with atherosclerosis risk. PLoS Genet.

[8] Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol. Cell

[9] A circRNA from SEPALLATA3 regulates splicing of its cognate mRNA through R-loop formation. Nat. Plants.

[10] Transforming activity of an oncoproteinencoding circular RNA from human papillomavirus. Nat. Commun.

[11] An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat. Neurosci.